Arno Krieger (Universität Bielefeld)
Arno Krieger erhielt den Preis für die beste pflanzenwissenschaftliche Master-Arbeit, die an der Universität Bielefeld im Jahr 2024 erstellt wurde, von der Deutschen Botanischen Gesellschaft für die Arbeit:
Reduzierung von transgenem Silencing in C. reinhardtii – Analyse der Wechselwirkungen zwischen Silencing-Faktoren mittels Genom-Editierung
Krieger hat mithilfe von CRISPR/Cas9-vermittelter Genomeditierung eine Reihe von C. reinhardtii Stämmen generiert, die jeweils unterschiedliche Kombinationen an Knock-out-Mutationen tragen, mit dem Ziel die Funktion verschiedener Silencing-Faktoren und mögliche Synergismen zwischen den Faktoren systematisch zu untersuchen und einen Stamm zu entwickeln, der Transgene auf hohem Niveau exprimieren kann.
Die einzellige Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii gewinnt zunehmend an Bedeutung als biotechnologischer Produktionsorganismus. Die Fähigkeit unter phototrophen Bedingungen schnell zu Wachstum, gepaart mit einem haploiden Genom und etablierten Methoden zur genetischen Manipulation, macht sie zu einer nachhaltigen Alternative zu heterotrophen Wirten für die biotechnologische Synthese von wirtschaftlich relevanten Verbindungen. C. reinhardtii verfügt über ein breites Spektrum an biosynthetischen Kapazitäten und bietet einzigartige Eigenschaften für kommerzielle Anwendungen. Fortschritte im Bereich des metabolischen Engineerings haben es ermöglicht, mit C. reinhardtii eine Vielzahl rekombinanter Proteine und hochwertiger Moleküle wie Algen-basierte Pharmazeutika, Biokraftstoffe und Terpenoide zu produzieren.
Mechanismen des Transgen-Silencing stellen jedoch eine Herausforderung für die Expression von Transgenen in C. reinhardtii dar und schränken ihr biotechnologisches Potenzial ein. In C. reinhardtii erfolgt das Transgen-Silencing hauptsächlich auf Chromatin-Ebene, wobei epigenetische Modifikationen wie Histondeacetylierung, -methylierung, -phosphorylierung und DNA-Methylierung eine Rolle spielen. Obwohl einige Schlüsselfaktoren des Transgen-Silencing identifiziert wurden, sind die Mechanismen und Interaktionen dieser Faktoren noch unzureichend verstanden.
Ziel dieser Arbeit ist es, Transgen-Silencing in C. reinhardtii durch Genom-Editierung zu verhindern, um Stämme mit stabiler Transgenexpression zu generieren. Dazu wurden mehrere epigenetische Schlüsselfaktoren, darunter SRTA, HLM4, VIG1, Mut9 und DMC5, unter Verwendung von CRISPR/Cas9 ausgeschaltet. Um das Expressionslevel von Transgenen in den mutierten Stämmen zu untersuchen, wurden alle Stämme mit einem Reporter-Konstrukt transformiert, das eine Patchoulolsynthase, fusioniert mit dem einem Fluoreszenzreportergen, trägt. Die Transgenexpression wurde durch Quantifizierung des Fluoreszenzsignals und der Patchoulol-Produktivität analysiert und vergleichen.
Die Studie zeigte, dass CRISPR/Cas9 basierte Stammkonstruktion ein leistungsstarkes Werkzeug zur Verbesserung der Transgenexpression in C. reinhardtii darstellt. Es wurde nachgewiesen, dass epigenetische Transgen-Silencing Mechanismen durch die Ausschaltung der zugrunde liegenden Schlüsselfaktoren teilweise verhindert werden können. Zudem zeigte sich, dass die Kombination bestimmter Knock-Out Mutationen synergistische und teilweise additive Effekte bei der Repression des Transgen-Silencing haben. Insbesondere die Kombination der Knock-Outs von SRTA, DMC5 und VIG1 führte zu einer robusten Transgenexpression und einer bis zu 400% höheren Patchoulol-Produktivität im Vergleich zum Ausgangsstamm. Darüber hinaus wurde eine Sammlung von 28 Knock-Out Stämmen erstellt, die eine Grundlage zur Entschlüsselung der zugrundeliegenden Silencing-Mechanismen bietet. Durch den Vergleich der Expressionsstärke von Transgenen dieser Knock-Out Stämme konnten hypothetische Interaktionen zwischen verschiedenen epigenetischen Modifikationen und Silenzierungsfaktoren beobachtet werden.
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Arno Krieger fertigte die Arbeit in der Arbeitsgruppe Algenbiotechnologie und Bioenergie von Prof. Olaf Kruse unter der Betreuung von Herrn Dr. Alexander Einhaus an.
